在全世界范围内，干旱胁迫都是一个影响作物生产的限制性因素，面临干旱胁迫时，高等植物有形态、生理、生化方面等策略来减少对自身的不利影响(Li et al., 2008)。其中合成脯氨酸、甜菜碱、甘露醇等渗透调节剂是一种重要的途径。

甜菜碱可以保护生物大分子在高电解质浓度下不变性，维持细胞的膨压(王均华等, 2008)，不干扰细胞的结构和功能(张明等, 2007)，并且在胁迫解除后的恢复期间具有加速蛋白质合成的作用，是一种重要的渗透调节剂。

甜菜碱广泛存在于动物、植物和微生物中，在高等植物体内，甜菜碱的合成是由胆碱为底物，经二步氧化反应生成，其反应为：胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱，前一个反应由胆碱单加氧酶(choline monooxygenase, CMO)催化，而后一个反应由甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)催化(Sakamoto and Murata, 2000)。陈丽萍和何道一(2010)认为BADH是关键酶，可见BADH在甜菜碱的生物合成中起着重要的作用。BADH基因没有信号肽，其表达产物在不同的物种中存在的位置不同，有报道发现它在菠菜中定位于叶绿体基质，而在水稻中则定位于溶酶体(McNeil et al., 1999; 沈义国等, 2001)。

目前，已从菠菜(马德钦等, 1996; 梁峥等, 1997)、梭梭(石磊等, 2010)、川芎(周嘉裕和廖海, 2011)、小麦(李永华等, 2007)、盐爪爪(曾幼玲等, 2007)、盐穗木(关波等, 2010)、麻风树(张富丽等, 2008)、枸杞(田跃胜等, 2010)、辽宁碱蓬(李秋莉等, 2006)等植物中克隆了BADH基因并对其进行了功能研究。但在油菜(Brassica napus)中关于BADH基因对干旱胁迫耐受影响的研究并不多见。我国油菜主栽区的季节性干旱可能导致15%~50%的减产甚至绝收(肖庆生等, 2012)，可见提高油菜对干旱胁迫的耐受性，保证其在胁迫条件下的稳产极为重要。传统育种方法选育对干旱和盐胁迫耐受的品种取得了一定的进展，但是随着分子生物学的发展，通过生物技术进行抗旱育种无疑是一条更有效的途径(王均华等, 2008; 陈丽萍和何道一, 2010)。

本研究根据拟南芥BADH1基因的序列设计特异性引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板扩增油菜BADH-1基因的全长，再用限制性内切酶把全长cDNA连接到真核表达载体pBI121上，以构建过量表达载体pBI121-BnBADH-1。为以后功能验证分析做好准备，进而对改善甘蓝型油菜对环境的耐受，保证其在胁迫条件下的稳产具有重要意义。

1结果与分析
1.1甘蓝型油菜BnBADH-1基因cDNA克隆与序列分析
使用Trizol试剂盒提取甘蓝型油菜叶片的总RNA (图1A)，再以总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₈为引物，进行反转录所得到总cDNA。再用总cDNA作为模板，用特异性引物B-1和B-2进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，获得了与预期大小相符的条带(图1B)；将该条带切胶回收，连接于pEASY-T1 Simple后得到重组载体pEASY-T1-BnBADH-1，转化大肠杆菌感受态；次日挑取到了形状规则的白斑，于LB+Amp液体培养基中大量培养后，做菌落PCR，结果表明，得到了阳性菌株(图2)；并同时将菌液送交测序，经测序确认，片段长度为1 506 bp。

图1 油菜BnBADH-1基因的扩增 Figure 1 PCR result of full length ORF of BnBADH-1 cDNA

图2 中间载体pEASY-T-BnBADH-1的PCR检测 Figure 2 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR products of pEASY-T-BnBADH-1

1.2甘蓝型油菜BnBADH-1基因序列分析
对BnBADH-1基因进行测序和分析发现，片段包含1 506 bp的开放阅读框，编码501个氨基酸残基的假定蛋白质，理论分子量为55 kD，等电点为5.16。与拟南芥BADH基因比较，核酸序列具有90.24%的同源性，而氨基酸序列具有93.41%同源性。进一步分析发现，该假定的BnBADH-1蛋白氨基酸序列中包含一段与通常甜菜碱醛脱氢酶中高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)相差2个氨基酸的VSMELGGKSP序列(图3)；以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(Cys)，该残基与催化作用相关；另外，5'端QLFIDGE不典型信号肽(图3)序列暗示BnBADH-1很可能定位于叶绿体(Weretilnyk and Hanson, 1990)。

图3 BnBADH-1与拟南芥BADH1(ALDH10A8)氨基酸序列的比对和重要位点分析 Figure 3 Alignment of BnBADH-1 and Arabidopsis thaliana BADH1(ALDH10A8) and analysis of important sites

1.3 BnBADH-1氨基酸序列同源性比较与系统进化树分析
BnBADH-1的氨基酸序列与盐爪爪(DQ923617)、拟南芥(ALDH10A8和ALDH10A9)、水稻(AB001348)、小麦(AAL05264)、菠菜(FJ595952)、盐地碱蓬(DQ641924)、滨藜(ABM97658)、红花(HQ439601)、藁本(HM352764)、白梭梭(JN547390)等植物BADH的氨基酸序列用DNAMAN软件计算出的氨基酸序列比对结果(图4)及系统进化树(图5)显示，本研究得到的油菜BnBADH-1蛋白与拟南芥BADH1(ALDH10A8)蛋白进化的关系最近，其氨基酸序列的同源性达到了93.41%；与NCBI上另一个来自油菜的BADH(AY351634)及拟南芥BADH2(ALDH10A9)关系稍远；与同为双子叶植物的红花和藁本BADH蛋白进化关系略远；而与单子叶植物水稻和小麦进化上则分支较早(图5)。

图4 BnBADH-1与其它多种植物BADH氨基酸序列的同源性比对 Figure 4 Alignment of BnBADH-1 and BADH from other species

图5 甘蓝型油菜与部分其它物种BADH氨基酸推导序列系统进化树 Figure 5 Phylogentic tree of BADH deductive sequence of Brassica nupus and other plant species

1.4表达载体的构建和检测
如图6中所示，以质粒pEASY-T1-BnBADH-1为模板，用带酶切位点及其保护碱基的引物B-E1 (带BamHⅠ位点)和B-E2 (带SacⅠ位点)进行PCR扩增，回收所得到的片段(图7A)，将该片段与pBI121载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切后，再将目的片段连接到pBI121载体的大片段上，用目的片段BnBADH-1替换掉pBI121载体上面原有的GUS报告基因，得到重组的表达载体pBI121-BnBADH-1。用一对分别结合在载体35S启动子和BnBADH-1片段内部的引物35S-1和ZJ-1检测发现，在预期的500 bp处得到明显的条带(图7B)；测序结果表明插入的目的片段BnBADH-1位置、方向及阅读框均正确，说明重组表达载体pBI121-BnBADH-1构建成功。

图6 双酶切构建BnBADH-1基因过量表达载体策略图 Figure 6 Strategy for construction of overexpressing vector of BnBADH-1 from B. napus by double digestions

图7 过量表达载体pBI121-BnBADH-1的构建 Figure 7 Construction of over expressing recombinant pBI121-BnBADH-1

2讨论
在影响植物形态的诸多非生物胁迫因子中，水分的供给是最重要的一种，广义地讲，包括干旱胁迫和盐胁迫(Zhu, 2002)。不仅离子平衡和渗透平衡被打破，还会活性氧而进一步毒害植物细胞(Wang et al., 2003)。

渗透调节是高等植物应对环境胁迫的一种基本的生理代谢，而甜菜碱是其中最重要的一种渗透调节剂(Chen and Murata, 2008; Zhang et al., 2011)。而甜菜碱合成是由胆碱为底物，先由CMO催化生成甜菜碱醛，甜菜碱醛再由BADH催化成为甜菜碱(Sakamoto and Murata, 2000)。近年来关于BADH功能的研究越来越多。例如Zhang等(2011)将菠菜BADH基因导入土豆后发现，在模拟的盐胁迫或者干旱胁迫下，转基因的株系的株高高于野生型，鲜重也重于野生型，即菠菜BADH提高了土豆对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性；Hasthanasombut等(2011)将印度耐盐型水稻OsBADH1导入日本盐敏感型水稻后，发现后者的耐盐性得到了提高；转辽宁碱蓬BADH基因的烟草也提高了对NaCl的耐受性(Li et al., 2003)。但是关于油菜BADH基因的报道却很少见。油菜是我国最重要的油料作物之一，我国的油菜种植面积和总产量位于世界首位。除传统育种外，分子生物学技术越来越受到各方面的重视，所以研究油菜BADH等与胁迫耐受相关的基因的功能，就具有理论上和生产上双重的重要意义。

本研究根据拟南芥的已知序列设计特异性引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板扩增出了一个全长为1 506 bp的片段(图1B)，经分析发现它编码一个含501个氨基酸残基的假定蛋白质、其分子量约为55 kD、等电点(pI)为5.16；进一步的核酸序列和氨基酸序列分析发现，BnBADH-1与拟南芥BADH1的同源性分别为90.24%和93.41% (图3)；BnBADH-1编码的假定蛋白所含的VSMELGGKSP序列与拟南芥BADH1相同，与已知其它物种BADH中高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)相差2个氨基酸。这种差异对酶功能和活性的影响暂时未知，但这至少说明油菜和拟南芥在进化关系比其它几个物种更近。进一步分析发现，油菜BnBADH-1蛋白与拟南芥BADH1蛋白进化关系最近；与同为双子叶植物红花和藁本BADH蛋白进化关系略远；而与单子叶的水稻和小麦进化上则分支较早(图5)。

利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段正向连接在真核表达载体pBI121上，PCR鉴定表明，过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建(图7)，为下一步的基因功能分析做好了准备。

3材料与方法
3.1植物材料及试剂
甘蓝型油菜种子由本实验室保存；真核表达载体pBI121由四川大学生命科学学院杨毅教授提供；高保真DNA聚合酶TansTaq-T DNA Polymerase、T载体pEASY-T1 Simple和大肠杆菌感受态购于全式金公司；植物总RNA提取试剂盒(Trizol)和胶回收纯化试剂盒购于TiANGEN公司；反转录试剂盒购自Takara公司；其他化学试剂为国产分析纯。

3.2油菜的培养条件
将甘蓝型油菜种子经75%乙醇浸泡1 min，0.1%升汞浸泡8 min消毒处理后，用灭菌水反复洗3~5次，然后置于MS固体培养基(Murashige and Skoog, 1962)上；于人工气候箱内25℃，相对湿度70%，16 h光照/8 h黑暗的条件下生长。

3.3油菜总RNA的提取及总cDNA的合成
取萌发后约3周左右的油菜叶片，采用Trizol试剂盒提取总RNA；所得的总RNA用RNase-free DNaseⅠ去掉残余DNA后，再用反转录试剂盒生成第一链cDNA：用Oligo(dT)₁₈引物进行反转录，经42℃孵育30 min后，85℃加热5 min使酶失活。所得的cDNA在-20℃保存，以备后续PCR使用。

3.4基因全长的扩增
PCR体系按cDNA 1 μL，dNTP 2 μL，Buffer (含Mg²⁺) 2 μL，上下游引物(B-1: 5'-ATGGCGATTCCGATGCCTACTC-3'; B-2: 5'-TTAGTTGGGAGATTTGTACCAT-3')各1 μL，酶TansTaq-T 0.2 μL，ddH₂O 12.8 μL (共20 μL)混合，其程序为：95℃预变性5 min，反应36个循环：95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，然后72℃终延伸8 min，4℃终止反应并保存。

3.5序列分析和结构预测
上一步的PCR产物经由2%琼脂糖凝胶电泳后，回收大小正确的片段，直接连接在T载体pEASY-T1 Simple上，转化大肠杆菌感受态并涂布LB+Amp (萨姆库鲁克和拉塞尔, 2002)固体培养基平板。37℃隔夜培养后，挑取形状规则的白斑，于LB+Amp液体培养基中培养并做菌落PCR，体系和程序同上。将扩增出大小正确条带的菌液送交测序。序列结果的比对分析和假定蛋白质的初步预测用DNAman软件完成。

3.6真核表达载体的构建
根据测序结果，重新设计特异性的上下游引物，并分别加上BamHⅠ和SacⅠ酶切位点(B-E1: 5'-CGGATCCATGGCGATTCCGATGCCTACTC-3'; B-E2: 5'-CGAGCTCTTAGTTGGGAGATTTGTACCAT-3'; 图6)。提取上步所得阳性菌质粒作模板做PCR扩增，体系和程序如前所述。该步所得到的条带与载体pBI121分别用BamHⅠ和SacⅠ做双酶切(图6)。由2%琼脂糖凝胶电泳后，分别回收PCR产物双酶切的片段以及载体pBI121双酶切的大片段，用T4连接酶连接，并转化大肠杆菌感受态，挑选菌落，并用引物(35S-1: 5'-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3'; ZJ-1: 5'-GTCCCACAACTCCAATAGGTT-3')检测片段插入。如果得到约500 bp的片段，则认定为阳性菌落，即BnBADH-1片段正向连接到pBI121载体上。

作者贡献
柴靓和李浩杰是本研究的实验设计和实验研究的执行人；蒲晓斌、张锦芳、蒋俊、胡海兵和郑本川参与论文初稿的写作与修改；蒋梁材是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金、国家863计划(2011AA10A104)、国家科技支撑计划(2011BAD35B04)、四川省育种攻关(2011NZ0098-5, 2011NZ0098-25)、四川省财政基因工程(2011JYGC04013)、四川省农业创新团队建设专项资金和四川省杰出青年学术技术带头人培育计划(2010JQ0054)共同资助。

参考文献
Chen L.P., and He D.Y., 2010, Research advance on drought and salt resistant genes in transgenic plant, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biolog), 29(3): 542-549 (陈丽萍, 何道一, 2010, 植物抗旱耐盐基因的研究进展, 基因组学与应用生物学, 29(3): 542-549)

Chen T.H.H., and Murata N., 2008, Glycinebetaine: an effective protectant against abiotic stress in plants, Trends Plant Sci., 13(9): 499-505

Guan B., Hu Y.Z., Zhang F.C., and Zeng Y.L., 2010, Molecular cloning and expression analysis of betaine-aldehyde dehydrogenase gene from Halostachys caspica (Bieb.) C. A. Mey, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Communications), 46(1): 47-50 (关波, 胡有贞, 张富春, 曾幼玲, 2010, 盐穗木甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的克隆及其在盐胁迫下的表达分析, 植物生理学通讯, 46(1): 47-50)

Hasthanasombut S., Supaibulwatana K., Mii M., and Nakamura I., 2011, Genetic manipulation of Japonica rice using the OsBADH1 gene from Indica rice to improve salinity tolerance, Plant Cell Tissue Organ Cult., 104(1): 79-89

Li Q.L., Gao X.R., Yu X.H., Wang X.Z., and An L.J., 2003, Molecular cloning and characterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Suaeda liaotungensis and its use in improved tolerance to salinity in transgenic tobacco, Biotechnol. Lett., 25(17): 1431-1436

Li Q.L., Zhang Y., Yin H., and Li D., 2006, Isolation of BADH Gene Promoter from Suaeda liaotungensis and its Sequence Analysis, Shengwu Gongcheng Xuebao (Chinese Journal of Biotechnology), 22(1): 77-81 (李秋莉, 张毅, 尹辉, 李丹, 2006, 辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)启动子分离及序列分析, 生物工程学报, 22(1): 77-81)

Li W.X., Oono Y., Zhu J.H., He X.J., Wu J.M., Iida K., Lu X.Y., Cui X.P., Jin H.L., and Zhu J.K., 2008, The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance, The Plant Cell, 20: 2238-2251

Li Y.H., Shang Y.P., Yang F.R., Yang Q.S., and Zou Q., 2007, Transformation and expression of Nicotiana tobaccum L. with a gene encoding for the betaine aldehyde dehydrogenade (BADH) from Triticum aestivum L., Henan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Henan Agricultural University), 41(1): 12-20 (李永华, 尚玉萍, 杨芳绒, 杨秋生, 邹琦, 2007, 小麦甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的转化及表达, 河南农业大学学报, 41(1): 12-20)

Liang Z., Ma D.Q., Tang L., Hong Y.G., Luo A.L., and Dai X.Y., 1997, Expression of the spinach betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) gene in transgenic tobacco plants, Shengwu Gongcheng Xubao (Chinese Journal of Biotechnology), 13(3): 236-240 (梁峥, 马德钦, 汤岚, 洪益国, 骆爱玲, 戴秀玉, 1997, 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达, 生物工程学报, 13(3): 236-240)

Ma D.Q., Lv W., Tang L., Luo A.L., and Liang Z., 1996, A cDNA cloning and sequence encoding betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) from spinach, Shengwu Gongcheng Xubao (Chinese Journal of Biotechnology), 12(1): 65-70 (马德钦, 吕文, 汤岚, 骆爱玲, 梁峥, 1996, 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析, 生物工程学报, 12(1): 65-70)

McNeil S.D., Nuccio M.L., and Hanson A.D., 1999, Betaines and related osmoprotectants targets for metabolic engineering of stress resistance, Plant Physiol., 120(4): 945-949
Murashige T., and Skoog F., 1962, A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15(3): 473-497

Sakamoto A., and Murata N., 2000, Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and impli- cations for enhancement of stress tolerance, J. Exp. Bot., 51(342): 81-88

Sambrook J., and Russell D.W., eds., Huang P. T., trans., 2002, Molecular cloning: a laboratory manual, Science Press, Beijing, China, pp.1595-1599 (萨姆库鲁克 J., 拉塞尔 D.W., 主编, 黄培堂, 主译, 2002, 分子克隆实验指南, 科学出版社, 中国, 北京, pp.1595-1599)

Shen Y.G., Du B.X., Zhang J.S., and Chen S.Y., 2001, Cloning and characterization of CMO gene from Atriplex hortensis, Shengwu Gongcheng Xubao (Chinese Journal of Biotechnology), 17(1): 1-6 (沈义国, 杜保兴, 张劲松, 陈受宜, 2001, 山菠菜胆碱单氧化物酶基因(CMO)的克隆与分析, 生物工程学报, 17(1): 1-6)

Shi L., Gan X.Y., Chen Y.C., Chen X.J., Li M., and Song Y.X., 2010, Cloning and sequence analysis of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Haloxylon ammodendron, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 30(2): 223-228 (石磊, 甘晓燕, 陈虞超, 陈晓军, 李苗, 宋玉霞, 2010, 梭梭甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及序列分析, 西北植物学报, 30(2): 223-228)

Tian Y.S., Xu J.T., Tang K.X., Li S., and Zhao J.Y., 2010, cDNA cloning and expression analysis of the BADH gene encoding a betaine aldehyde dehydrogenase in swordlike atractylodes rhizome (Lycium barbarum), Yangzhou Daxue Xuebao (Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 31(2): 48-52 (田跃胜, 许洁婷, 唐克轩, 李杉, 赵静雅, 2010, 枸杞甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA的克隆与表达分析, 扬州大学学报(农业与生命科学版), 31(2): 48-52)

Wang J.H., Su B., Ma C., Wang G.S., and Shen X., 2008, Progress on genetic engineering of drought resistance in plants, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 1: 20-24 (王均华, 苏波, 马冲, 王国胜, 沈向, 2008, 植物抗旱基因工程研究进展, 生物技术通报, 1: 20-24)

Wang W.X., Vinocur B., and Altman A., 2003, Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance, Planta, 218(1): 1-14
Weretilnyk E.A., and Hanson A.D., 1990, Molecular cloning of a plant betaine-aldehyde dehydrogenase, an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87(7): 2745-2749

Xiao Q.S., Zhang X.K., Xu B.B., Cheng Y., Zheng P.Y., and Lu G.Y., 2012, Cloning and expression pattern of AnnBn1 gene in Brassica napus, Zhongguo Youliao Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Oil Crop Sciences), 34(2): 123-128 (肖庆生, 张学昆, 许本波, 程勇, 郑普英, 陆光远, 2012, 甘蓝型油菜AnnBn1基因的克隆和表达分析, 中国油料作物学报, 34(2): 123-128)

Zeng Y.L., Xing T., Cai Z.Z., and Zhang F.C., 2007, Molecular cloning and expression analysis of betaine aldehyde dehydrogenase gene from the halophyte kalidium foliatum (chenopodiaceae) in Xinjiang on salinity, Yunnan Zhiwu Yanjiu (Acta Botanica Yunnanica), 29(1): 79-84 (曾幼玲, 幸婷, 蔡忠贞, 张富春, 2007, 盐生植物盐爪爪甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及在盐胁迫下的BADH基因的表达, 云南植物研究, 29(1): 79-84)

Zhang F.L., Cai F., Wu J., Chen F., Wang Y.X., Zhao X.G., and Gao S., 2008, Enhancing salt tolerances of tobacco by transformation of Jatropha curcas betaine aldehyde dehydrogenase gene, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 41(12): 4030-4038 (张富丽, 蔡峰, 吴军, 陈放, 王云霄, 赵小光, 高顺, 2008, 转麻疯树甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草耐盐性, 中国农业科学, 41(12): 4030-4038)

Zhang M., Lu Y., and Wang X.F., 2007, Dehydration-induced intracellular solute changes and acquisition of plant desiccation tolerance, Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao (Journal of Plant Physiology and Molecular Biology), 33(1): 9-17 (张明, 卢昀, 汪晓峰, 2007, 脱水导致的胞内溶质变化与植物耐干性的获得, 植物生理与分子生物学学报, 33(1): 9-17)

Zhang N., Si H.J., Wen G., Du H.H., Liu B.L., and Wang D., 2011, Enhanced drought and salinity tolerance in transgenic potato plants with a BADH gene from spinach, Plant Biotechnol. Rep., 5(1): 71-77

Zhou J.Y., and Liao H., 2011, Molecular cloning and analysis of betaine aldehyde dehydrogenase gene of Liqusticum chuanxiong franch hort, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica), 20(3): 45-51 (周嘉裕, 廖海, 2011, 川芎甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析, 西北农业学报, 20(3): 45-51)

Zhu J.K., 2002, Salt and drought stress signal transduction in plants, Annu. Rev. Plant Biol., 53: 247-273